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Periférico CD4 sangue + CD25 + CD127 baixas células T reguladoras são significativamente aumentada por tratamento Tocilizumab em pacientes com artrite reumatóide:

immune-system-101 (1)

Periférico CD4 sangue + CD25 + CD127 baixas células T reguladoras são significativamente aumentada por tratamento Tocilizumab em pacientes com artrite reumatóide: aumento das células T reguladoras correlaciona-se com a resposta clínica

  • Junho Kikuchi ,
  • Misato Hashizume ,
  • Yuko Kaneko ,
  • Keiko Yoshimoto ,
  • Naoshi Nishina e
  • Tsutomu Takeuchiemail autor
Arthritis Research & Therapy201517 : 10

DOI: 10,1186 / s13075-015-0526-4

Recebido: 15 de agosto de 2014

Aceito: 12 de janeiro de 2015

Publicação: 21 de janeiro de 2015

Abstrato

Introdução

Tocilizumab (TCZ), um anticorpo anti-receptor de interleucina-6, é clinicamente eficaz contra a artrite reumatóide (RA), e vários relatórios têm indicado como TCZ influencia um número de mecanismos subjacentes patogénese da AR. No entanto, ainda não está claro se TCZ afeta células inflamatórias no sangue periférico e se tais alterações estão associadas com a resposta clínica. Foram avaliadas as associações entre as proporções de subconjuntos de células imunitárias periféricas e resposta clínica em pacientes com AR tratados com TCZ.

Métodos

Trinta e nove pacientes consecutivos com AR que começaram a receber TCZ como sua primeira biológica entre março de 2010 e abril de 2012, foram inscritos. As proporções de vários subconjuntos de células periféricas com os seus níveis de expressão de marcadores de diferenciação, e marcadores de activação de moléculas co-estimuladoras foram medidas sequencialmente a partir da linha de base até à semana 52 por análise de citometria de fluxo.

resultados

Clinical Disease Activity Index (CDAI) remissão foi alcançada em 53,8% dos pacientes na semana 52 da terapia TCZ. As proporções de células CD4 + CD25 + CD127 baixas células T reguladoras (T Reg ) e HLA-DR + T activadas reg células aumentou significativamente com terapia TCZ ( P  <0,001 e P  <0,001, respectivamente), enquanto as proporções de células CD3 + CD4+ CXCR3 CCR6 + CD161 + células T helper 17 não se alterou ao longo dos 52 semanas. As proporções de CD20 + CD27 +células B de memória, HLA-DR + CD14 + e CD69 + CD14 + em monócitos activados, e CD16 + CD14 + monócitos diminuiu significativamente ( P  <0,001, P  <0,001, P  <0,001 e P  <0,001, respectivamente). Entre eles, apenas a alteração no T regcélulas foi inversamente correlacionada com a mudança na pontuação CDAI (ρ = -0,40, P  = 0,011). O aumento mais dinâmica em T- reg células foi observada no grupo de remissão CDAI ( P  <0,001).

Conclusão

Este estudo demonstra que TCZ afetados proporções de circulando células do sistema imunológico em pacientes com AR.A proporção de t reg células entre células CD4 + células bem correlacionados com a resposta clínica.

Introdução

Células T (especialmente células CD4 + células T), os monócitos e as células B são considerados para ser envolvido na patogénese da artrite reumatóide (RA) [ 1 ]. Frequentemente considera-se que a diminuição do número e / ou actividade de linfócitos e outras células do sistema imune por tratamento da AR pode reduzir a actividade da doença. A primeira evidência disso foi visto em ensaios clínicos preliminares em que visam CD4 + células T com anticorpos monoclonais anti-CD4 (mAbs) resultou em melhora clínica da AR, embora apenas modestamente [ 2 ]. Abatacept, um T de antigénio de linfócitos a proteína de fusão recombinante 4 imunoglobulina citotóxico que inibe de CD4 + activação das células T por bloqueio de co-estimulação com células apresentadoras de antigénio, tais como as células B e monócitos, demonstrou eficácia clínica contra o AR e tem sido aprovado em todo o mundo para o tratamento da AR [ 3 ]. A depleção de células B periféricas por o rituximab anticorpo anti-CD20, também melhora a actividade da doença [ 4 ].

O anti-receptor de interleucina-6 (IL-6R) do anticorpo Tocilizumab (TCZ) também é clinicamente eficaz contra RA [ 5 ]. Vários estudos demonstraram que o bloqueio da sinalização de IL-6 com TCZ pode afectar proporções de células do sangue periférico. Dado que a IL-6 foi originalmente identificada como um factor de diferenciação de células B [ 6 , 7 ], não é surpreendente que afecta TCZ proporções de populações de células B em pacientes com AR. A IL-6 também influencia a diferenciação de células T em células T efectoras (T H 1, T H 2 e T H 17 células) ou as células T reguladoras (T reg ) [ 810 ].Em estudos recentes, investigadores têm mostrado que a IL-6 bloqueio poderia afectar favoravelmente o T H 17 / t Regdesequilíbrio de células em pacientes com AR [ 11 , 12 ]. Além disso, a IL-6 parece afectar a proliferação e a activação de monócitos que expressam IL-6R [ 13 , 14 ]. No entanto, porque, em estudos anteriores, o número de pacientes, a duração dos estudos e as populações de células examinadas estavam limitados, não é claro se existe uma população chave de células imunitárias periféricas que atenua os sintomas clínicos RA através de terapias anti-IL-6R [ 11 , 12 , 15 ]. Se essas relações podem ser esclarecidas, permitiria pesquisadores médicos para compreender a patogênese da AR do ponto de vista das populações de linfócitos e encontrar marcadores substitutos a fim de escolher uma estratégia terapêutica ideal para a RA.

O objectivo primário deste estudo foi avaliar vários tipos diferentes de células do sangue periférico por meio de análise de citometria de fluxo para identificar populações modulados por terapia anti-IL-6R. O objectivo secundário foi determinar se qualquer uma dessas populações está fortemente associada com várias medidas clínicas em resposta à terapia anti-IL-6R.

Métodos

Pacientes

Os pacientes elegíveis foram aqueles que preencheram os critérios revistos de 1987 do American College of Rheumatology (ACR) para a classificação de RA ou os 2010 ACR / Liga Europeia contra o Reumatismo (EULAR) critérios de classificação [ 16, 17 ]. Pacientes consecutivos no nosso instituto que iniciaram TCZ como seu primeiro agente biológico entre março de 2010 e abril de 2012, foram inscritos. Todos eles apresentaram resposta insuficiente para pelo menos uma droga convencional sintético anti-reumático modificadores da doença (csDMARD). Os pacientes inscritos foram administradas de 8 mg / kg a cada 4 semanas TCZ, com ou sem outros csDMARDs, incluindo o metotrexato (MTX). O protocolo do estudo foi aprovado pelo comitê de ética na Keio University School of Medicine e foi realizado em conformidade com a Declaração de Helsínquia e Boas Práticas Clínicas. Consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes.

avaliação e avaliação da eficácia clínica

características demográficas e clínicas, incluindo idade, sexo, duração da doença, contagem de articulações concurso (TJC), inchada contagem de articulações (SJC), avaliação global do paciente (paciente escala visual analógica (Pt-VAS)), avaliação global pelo médico (escala visual analógica do médico ( D-VAS)), Avaliação do Questionário de Saúde Índice de Incapacidade (HAQ-DI) pontuação, proteína C-reativa (CRP) de nível, taxa de sedimentação de eritrócitos (ESR), (-3 MMP) nível de metaloproteinase-3, fator reumatóide (FR) valor e valor anticorpo anticíclica peptídeo citrullinated (CCP) foram obtidos a partir dos prontuários dos pacientes.

A atividade da doença foi avaliada utilizando o Índice Clínico de Atividade de Doença (CDAI) e Índice de Atividade da Doença Simplificado (SDAI). Os valores de corte para a remissão, a baixa atividade da doença (LDA), atividade da doença moderada (MDA) e alta atividade da doença (HDA) foram os seguintes: para a remissão, CDAI ≤2.8, SDAI ≤3.3; para LDA, 2,8 <CDAI ≤ 10, 3,3 <SDAI ≤ 11; para MDA, 10 <CDAI ≤ 22, 11 <SDAI ≤ 26; e para HDA, CDAI> 22, SDAI> 26 [ 18 ].

coloração da superfície celular e citometria de fluxo de análise

células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram obtidos no início do estudo e nas semanas 24 e 52 do tratamento TCZ. As PBMC foram separadas por gradiente de densidade com Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) e criopreservadas em CELLBANKER 1 (Nippon Zenyaku Kogyo, Fukushima, Japão) até à sua utilização. As células descongeladas foram coradas durante 30 minutos à temperatura ambiente sob condições de escuridão, com os seguintes mAbs marcados com fluoróforo: anti-CD4-VioGreen (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha); anti-CD3-Pacific Blue / isotiocianato de fluoresceína (FITC), CD8-anti-Pacific Blue, anti-CD14- (APC) -Cy7, anti-CD20-cianina 7 aloficocianina (APC-Cy7), anti-CD25 ficoeritrina (PE) -Cy5, anti-CD27-PE-Cy7, anti-CD38-PE-Cy5 anti-CD45RO-PE-Cy7, anti-CD56-PE / PE-Cy7, anti-CD69-APC / PE-Cy7, anti-CD80 -FITC, anti-CD86-PE-Cy5 anti-CD127-FITC, anti-CD161-APC, anti-quimioquina (motivo CXC) do receptor 3 (CXCR3) -PE e anti-HLA-DR-APC / APC-Cy7 ( todos os produtos da BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA); -Anti-CD16 violeta brilhante 510 e anti-violeta brilhante CCR6 421 (ambos de BioLegend, San Diego, CA, EUA); e anti-imunoglobulina de ratinho G controlos do mesmo isotipo (VioGreen de Miltenyi Biotec, os outros a partir de BD Biosciences).

As células coradas foram lavadas duas vezes com 2 ml de solução salina tamponada com fosfato e analisadas num analisador MACSQuant (Miltenyi Biotec). As células mortas foram confirmados com uma solução de iodeto de propidio de fluorescência (Miltenyi Biotec) e excluídos com base em sinais de dispersão. Os subconjuntos analisados ​​foram células T CD4 e CD8 (incluindo a memória, efectora e marcadores de activação) e T H 1, T H 2, T H 17, T reg , células B, células assassinas naturais, e monócitos, incluindo os seus sub-populações e marcadores de activação . As subpopulações de células periféricas identificados neste estudo foram definidos por meio de marcadores de superfície celular com base em subconjuntos de células periféricas descritos em um relatório anterior (arquivo adicionais 1 : Tabela S1) [ 19 ].

análise estatística

Os dados contínuos são apresentados como mediana e intervalo interquartil (IQR) ou como um número com valor percentual, conforme o caso. O teste de Wilcoxon e Kruskal-Wallis foram utilizados para examinar as diferenças entre variáveis ​​contínuas. Correlação de duas variáveis ​​contínuas foi analisada pelo coeficiente de correlação de Spearman. O teste exato de Fisher foi utilizado para comparar a proporção de dados categóricos entre os grupos. A P -valor <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todas as análises estatísticas foram realizadas com 10 JMP (SAS Institute, Cary, NC, EUA).

resultados

As características basais dos pacientes e associações entre as populações de células periféricas e atividade da doença no início do estudo

Tabela  1 mostra os dados demográficos de base e características clínicas dos pacientes inscritos ( N  = 39). Nesta população, não houve diferença entre TCZ monoterapia e TCZ em combinação com MTX em termos de características de base.

tabela 1

Demografia basal do paciente e características clínicas de

As características dos pacientes, N = 39

Média ± DP ou N (%)

Mediana (IQR)

Idade, yr

54,8 ± 13,3

56 (44 a 63)

Feminino, n (%)

35 (89,7)

A duração da doença, yr

4,7 ± 3,3

4,5 (1,7 a 8,0)

SJC (variação de 0 a 28)

5,8 ± 3,8

5 (3-7)

TJC (variação de 0 a 28)

5,0 ± 3,5

4 (3-6)

Pt-VAS (score / 100 mm)

46,2 ± 24,5

45 (30 a 63)

D-VAS (score / 100 mm)

42,3 ± 16,7

39 (32 a 54)

pontuação CDAI

19,6 ± 9,3

17,5 (12,0-25,2)

pontuação SDAI

21,1 ± 9,9

19,8 (13,4-26,9)

pontuação HAQ-DI

1,0 ± 0,7

1 (0,5 a 1,5)

CRP, mg / dl

1,4 ± 1,6

0,7 (0,2 a 2,2)

ESR, mm / h

48,1 ± 32,0

46 (19 a 68)

MMP-3, ng / mL

158,5 ± 147,7

100,2 (60,0-221,0)

RF-positivas, n (%)

33 (84,6)

ACPA-positivas, n (%)

33 (84,6)

Metotrexato concomitante, n (%), a dose, b mg / semana

12 (30,8), 8,0 ± 1,2

-, 8,0 (7,6 a 8,0)

Glucocorticóide concomitante, n (%), a dose, b mg / dia

10 (25,6), 5,1 ± 2,8

-, 5 (3 a 5)

um anticorpo proteína ACPA, Anticitrullinated; CDAI, Clínica Índice de Atividade da Doença; CRP, proteína C-reativa; D-VAS, escala visual analógica do doutor; ESR, taxa de sedimentação de eritrócitos; HAQ-DI, Avaliação Health Questionnaire Disability Index; MMP-3, metaloproteinase de matriz-3; Pt-VAS, escala visual analógica do paciente; RF, o fator reumatóide; SDAI, Doença simplificado Índice de Atividade; SJC, contagem de articulações inchadas; TJC, Tender contagem de articulações. B Média ± desvio padrão (SD) e mediana (intervalo interquartil (IQR)) entre os pacientes que recebem medicamentos.

No início do estudo, uma proporção maior de HLA-DR + CD8 + células T entre os CD8 + células T foi significativamente associada com maior CRP, Pt-VAS, SDAI e HAQ-DI, bem como uma maior proporção de ingênua e memória CD8 + as células T CD8 entre os + células T, foi significativamente associada com RF, ACPA, SJC, CDAI e SDAI (arquivo adicionais 1 : Tabela S2).A maior proporção de T H 2 células entre os CD4 + células T também foi significativamente associada com TJC, D-VAS, Pt-VAS, CDAI e dezenas SDAI. Nenhum outro subconjuntos de linha de base ou marcadores de superfície correlacionadas com CDAI ou pontuação SDAI (arquivo adicionais 1 : Tabela S3).

Alterações da linha de base na resposta clínica

Todos os pacientes neste estudo receberam TCZ para toda a 52 semanas. As pontuações CDAI e SDAI (média ± desvio padrão) diminuiu significativamente de 19,6 ± 9,3 e 21,1 ± 9,9, respectivamente, no início do estudo para 5,5 ± 5,2 e 5,5 ± 5,2 na semana 24 e para 5,2 ± 6,0 e 5,6 ± 6,8 na semana 52 ( P  <0,0001). O número ea percentagem de pacientes classificados como tendo atingido a remissão ou como tendo LDA, MDA e HDA foram os seguintes CDAI e SDAI: no início do estudo, 0 (0%) 0 (0%) para a remissão, 3 (7,7%) e 4 (10,3%) de LDA, 24 (61,5%) e 25 (64,1%) de MDA, e 12 (30,8%) e 10 (25,6%) de HDA, respectivamente; e na semana 52, 21 (53,8%) e 22 (56,4%) para a remissão, 11 (28,2%) e 10 (25,6%) de LDA, 7 (17,9%) e 7 (17,9%) de MDA, e 0 ( 0%) e 0 (0%) para HDA, respectivamente (arquivo adicionais 1 : Figura S2).

Alterações da linha de base em subpopulações de células periféricas

As proporções de memória de CD4 + células T entre todas as células CD4 + células T, HLA-DR + CD8 + células T entre CD8 +células T, T reg células entre células CD4 + células T, HLA-DR + T reg células entre T reg células, células naive B entre todas as células B, CD16 e CD14 + monócitos entre CD14 + monócitos aumentou após o tratamento TCZ (Tabelas  2 e 3 ). Por outro lado, as proporções de células CD4 naive + células T entre todas as células CD4 + células T, HLA-DR + CD4 + células T entre CD4 + células T, CD86 + células B entre todas as células B, as células B de memória entre todas as células B , HLA-DR + CD14+ monócitos entre CD14 + monócitos, CD69 + CD14 + monócitos entre CD14 + monócitos, e CD16 + CD14 + monócitos entre CD14 + monócitos diminuíram após o tratamento TCZ (Tabelas  2 e 3 ). Os outros subgrupos e seus marcadores de ativação não foram significativamente alteradas durante a terapia TCZ.

mesa 2

As alterações nas proporções de subconjuntos e marcadores de superfície das células T durante o tratamento Tocilizumab

Subconjuntos e marcadores de superfície

Mediano (intervalo interquartil)

Linha de base versus semana 52

linha de base

semana 24

semana 52

P- valor

CD4 + células T / linfócitos

53,6 (47,3-59,4)

53,4 (47,3-58,4)

55,3 (49,5-60,5)

0,345

CD4 naive + células T CD4 / + células T

61,8 (57,7-69,3)

59,1 (53,7-62,2)

59,1 (51,8-61,8)

0,019 *

Memória de CD4 + células T CD4 / + células T

30,7 (30,7-42,3)

40,9 (37,8-46,3)

40,9 (38,2-48,2)

0,010 *

HLA-DR + CD4 + células T CD4 / + células T

3,2 (2,7-4,1)

3,1 (2,6-3,9)

2,6 (2-3,1)

0,005 *

CD38 + CD4 + células T CD4 / + células T

32,4 (26,3-38,5)

32,4 (28,4-39,4)

32,6 (29,3-40,1)

0,212

CD69 + CD4 + células T CD4 / + células T

0,1 (0-0,1)

0,1 (0-0,2)

0,1 (0,1 a 0,3)

0,016 *

CD8 + de células T / linfócitos

32,4 (28,4-38,1)

30,8 (26,9-37,1)

29,1 (26,4-33,1)

0,052

CD8 naive + células T / CD8 + de células T

60,8 (57,7-64,3)

62,1 (59,5-67,5)

62,7 (59,5-67,5)

0,087

Memória CD8 + de células T / CD8 + de células T

39,2 (35,7-42,3)

37,9 (33,9-41,5)

37,3 (32,5-40,5)

0,087

HLA-DR + CD8 + de células T / CD8 + de células T

16,4 (13,4-19,4)

18,3 (14,3-19,4)

19,4 (17,3-21,4)

0,005 *

CD38 + CD8 + de células T / CD8 + de células T

25,2 (15,9-36,7)

26,1 (19,3-31,4)

24,5 (19,4-30)

0,727

CD69 + CD8 + de células T / CD8 + de células T

1,3 (0,5 a 2,1)

1,3 (0,9-2,1)

0,9 (0,3 a 1,3)

0,057

T reg / CD4 + células T

3,6 (2,2-4,3)

4,2 (2,6-5,2)

5,6 (4,5-7,1)

<0,001 *

Naïve T reg / T reg células

52,8 (44,0-59,0)

47,7 (42,6-54,9)

49,6 (46,5-55,7)

0,242

T de memória reg / T reg células

47,2 (41-56,1)

52,3 (45,1-57,4)

50,4 (44,3-53,5)

0,242

HLA-DR + T reg / T reg células

14 (11,7-17,7)

16,8 (14,3-20,3)

18,4 (15,4-19,4)

<0,001 *

T H 1 / CD4 + células T

19 (14,8-20,8)

17,4 (15,3-19,3)

20,7 (15,9-22,9)

0,095

HLA-DR + T H 1 / T H 1 células

4,5 (3,4-5,7)

4,5 (3,4-5,7)

3,5 (2,2-5,6)

0,119

T H 2 / CD4 + células T

46,8 (37,7-54,3)

51,8 (42,5-58,7)

43,3 (34,6-49,1)

0,179

HLA-DR + T H 2 / T H 2 células

2,0 (1,2-3,1)

2,3 (1,9-2,9)

2,2 (1,8-2,9)

0,174

T H 17 / CD4 + células T

2,0 (0,78-3,2)

2,0 (1,4-3,2)

2,0 (1,5-3,6)

0,342

HLA-DR + T H 17 / T H 17 células

4,0 (3,4-4,4)

3.6 (3.1 a 4.1)

3,9 (3,3-4,2)

0,323

* diferenças significativas determinada utilizando-correspondida pares de Wilcoxon-rank assinado teste.

tabela 3

As alterações nas proporções de subconjuntos e marcadores de superfície de células B, células assassinas naturais e monócitos durante o tratamento Tocilizumab

Subconjuntos e marcadores de superfície

Mediano (intervalo interquartil)

Linha de base versus semana 52

linha de base

semana 24

semana 52

P -valor

células B / linfócitos

3,2 (2-5,1)

4.1 (3.1 a 5.2)

4.1 (3.1 a 5.2)

0,118

CD80 + células B / células B

26,9 (13,5-32)

19,3 (12,4-26,3)

19,3 (13,2-21,4)

0,045 *

CD86 + células B / células B

42,5 (36,5-47,6)

34 (29,2-38,1)

36,7 (32,1-41,9)

0,009 *

HLA-DR + células B / células B

99,6 (99-99,8)

99,4 (98,8-99,8)

99,5 (99,3-99,8)

0,833

células B naïve células / B

52 (43,1-60,3)

62,7 (52,7-68,2)

66,7 (57,6-74,6)

<0,001 *

células B de memória células / B

48 (39,7-56,9)

37,3 (31,8-47,3)

33,3 (25,4-42,4)

<0,001 *

células NK / linfócitos

24,1 (20,0-27,5)

25,8 (21,2-30,5)

24,5 (20,9-29,5)

0,401

CD80 + CD14 + monócitos / CD14 + monócitos

0,2 (0,1 a 0,3)

0,2 (0,1 a 0,3)

0,2 (0,1 a 0,3)

0,433

CD86 + CD14 + monócitos / CD14 + monócitos

99,6 (99,2-99,9)

99,7 (99,3-99,9)

99,8 (99,6-99,9)

0,054

HLA-DR + CD14 + monócitos / CD14 + monócitos

99,5 (89,3-99,8)

98,2 (89,7-99,6)

94,6 (86-95,8)

0,004 *

CD69 + CD14 + monócitos / CD14 + monócitos

66,7 (60,6-74,8)

48,3 (35,8-70,1)

34 (26,2-56,9)

<0,001 *

CD16 + CD14 + monócitos / CD14 + monócitos

16 (10,3-20,9)

8,6 (4,5-12,6)

8,1 (3,8-12,9)

<0,001 *

CD16 CD14 + monócitos / CD14 + monócitos

84 (79,1-89,7)

91,4 (87,4-95,5)

91,9 (87,1-96,2)

<0,001 *

* Diferenças significativas usando-correspondida pares de Wilcoxon-rank assinado teste.

Avaliação das relações entre subpopulações de células periféricas e resposta clínica após a terapia tocilizumab

As associações entre as alterações em subconjuntos de células periféricas e alterações em parâmetros clínicos (ΔCDAI e ΔSDAI) após tratamento TCZ estão resumidos na Tabela  4 . Observou-se uma correlação significativa entre a alteração na proporção de T reg células entre CD4 + células T e as mudanças na pontuação CDAI desde o início até a semana 52: quanto maior o aumento na proporção de T reg células entre CD4 + células T da linha de base semana 52, maior a melhoria na pontuação CDAI durante o mesmo período (ρ = -0,346, P  = 0,031). Além disso, a alteração na expressão de CD38 em células CD8 + de células T mais de 52 semanas foi negativamente correlacionado com a alteração na pontuação CDAI (ρ = -0,355, P  = 0,026). Os outros subconjuntos de células periféricas, incluindo CD4 naive e de memória + células T, HLA-DR +CD4 + células T, CD69 + CD4 + células T, HLA-DR + CD8 + células T, HLA-DR + T reg ingénuos e B de memória células, CD86 +células B, HLA-DR + CD14 + monócitos, CD69 + CD14 + monócitos, CD16 + CD14 + monócitos e CD16 CD14 + monócitos, as proporções dos que mudaram significativamente ao longo de 52 semanas (como mostrado acima), não demonstrou qualquer correlação com a mudança na pontuação CDAI. Os mesmos resultados foram encontrados quando ΔSDAI foi utilizado como o ponto final clínico.

tabela 4

Correlações de mudanças nas atividades de doença com alterações nos subconjuntos de células periféricas e marcadores de superfície após 52 semanas de tratamento com tocilizumab um

ΔCDAI

ΔSDAI

subconjunto

P -valor

ρ de Spearman

P -valor

ρ de Spearman

ΔCD4 + células T / linfócitos

0,273

0,180

0,342

0,156

ΔNaïve de CD4 + células T CD4 / + células T

0,653

-0,074

0,481

-0,116

ΔMemory de CD4 + células T CD4 / + células T

0,653

0,074

0,481

0,116

ΔHLA-DR + CD4 + células T CD4 / + células T

0,829

-0,036

0,710

-0,061

ΔCD38 + CD4 + células T CD4 / + células T

0,231

-0,196

0,089

-0,276

ΔCD69 + CD4 + células T CD4 / + células T

0,746

-0,054

0,476

-0,118

ΔCD8 + células T / linfócitos

0,698

-0,064

0,294

-0,172

ΔNaïve CD8 + de células T / CD8 + de células T

0,555

0,097

0,256

0,186

ΔMemory CD8 + de células T / CD8 + de células T

0,555

-0,097

0,256

-0,186

ΔHLA-DR + CD8 + de células T / CD8 + de células T

0,566

-0,095

0,955

0,009

ΔCD38 + CD8 + de células T / CD8 + de células T

0,026 *

-0,355

0,036 *

-0,337

ΔCD69 + CD8 + de células T / CD8 + de células T

0,686

-0,067

0,357

-0,152

AT reg / CD4 + células T

0,031 *

-0,346

0,033 *

-0,342

ΔNaïve T reg / T reg

0,930

0,015

0,612

0,084

ΔMemory T reg / T reg

0,924

-0,016

0,606

-0,085

ΔHLA-DR + T reg / T Reg

0.270

-0,181

0,279

-0,178

AT H 1 / CD4 + células T

0,847

-0,032

0,915

-0,018

ΔHLA-DR + T H 1 / T H 1

0,969

0,007

0,732

0,057

AT H 2 / CD4 + células T

0,354

0,153

0,312

0,166

ΔHLA-DR + T H 2 / T H 2

0,291

-0,173

0,152

-0,234

AT H 17 / CD4 + células T

0,593

-0,088

0,442

-0,127

ΔHLA-DR + T H 17 / T H 17

0,366

-0,149

0,229

-0,197

células ΔB / linfócitos

0,958

-0,009

0,709

-0,062

ΔCD80 + células B / células B

0.740

0,055

0,546

0,100

ΔCD86 + células B / células B

0,210

0,206

0,065

0,299

ΔHLA-DR + células B / células B

0,838

-0,034

0,841

-0.033

células ΔNaïve células B / B

0,291

-0,174

0,306

-0,168

células ΔMemory células B / B

0,291

0,174

0,306

-0,168

células ΔNK / linfócitos

0,559

0,097

0,506

0,110

ΔCD80 + CD14 + monócitos / CD14 + monócitos

0,645

-0,076

0,699

-0,064

ΔCD86 + CD14 + monócitos / CD14 + monócitos

0,440

0,127

0,776

0,047

ΔHLA-DR + CD14 + monócitos / CD14 + monócitos

0,415

-0,134

0,138

-0,242

ΔCD69 + CD14 + monócitos / CD14 + monócitos

0,430

-0,130

0,258

-0,186

ΔCD16 + CD14 + monócitos / CD14 + monócitos

0,120

-0,253

0,203

-0,208

ΔCD16 CD14 + monócitos / CD14 + monócitos

0,121

0,253

0,204

0,208

um CDAI, Clinical Disease Activity Index; HLA, antígeno leucocitário humano; NK, assassino Natural; SDAI, Doença simplificado Índice de Atividade; T H , célula T auxiliar; T reg , de células T reguladoras. * Correlação significativa por meio do coeficiente de correlação de Spearman.

Associação entre a alteração no T reg células e a eficácia da terapia tocilizumab

O decurso de tempo das alterações no T reg células como uma proporção de células T CD4 + células T é mostrado na Figura 1 A. A proporção média de T reg células aumentou significativamente ao longo de 52 semanas a partir de 3,6 (IQR, 2,2-4,3) para 5,6 (IQR 4,5-7,1) ( P  <0,001). A mudança na pontuação CDAI e SDAI na semana 52 foi significativamente associada com a mudança de T reg células na semana 52 (Tabela  4 , Figura  1 B). Dos 39 pacientes examinados neste estudo, 21 (53,8%) preencheram os critérios de CDAI para a remissão e 22 (56,4%) alcançaram remissão SDAI à semana 52. Quando dividimos os pacientes em dois grupos de acordo com seu estado de remissão na semana 52, a mudança na T de sangue periféricoreg células foi significativamente maior no grupo de remissão do que no grupo nonremission na semana 52 (Figura  1 C).Além disso, a proporção de T do sangue periférico reg células foi significativamente maior no grupo de remissão do que no grupo nonremission na semana 52 (Figura  1 D).

https://static-content.springer.com/image/art%3A10.1186%2Fs13075-015-0526-4/MediaObjects/13075_2015_526_Fig1_HTML.gif
figura 1

As relações entre os efeitos de Tocilizumab sobre a proporção de células T reguladoras e respostas clínicas. (A) a mudança cronológica na proporção de T reguladoras (T reg células entre CD4) + células T a partir da linha de base até a semana 52 de tocilizumab tratamento (TCZ). (B) As relações entre a mudança de atividades clínicas (Clinical Índice de Atividade de Doença ( Índice ΔCDAI) e simplificado de atividade de doença (ΔSDAI)) ea mudança na proporção de T reg células entre as células T CD4 + (ATreg / CD4) na semana 52. (C) as relações entre pontuações CDAI e SDAI na semana 52 e a mudança na proporção de T reg células entre CD4 + células T (AT reg / CD4) na semana 52. (D) as relações entre pontuações CDAI e SDAI na semana 52 e a proporção de Treg células entre CD4 + células T na semana 52. as praças significam medianas e intervalos interquartis, e os diamantes significam médias e intervalos de confiança de 95%. Os dados foram analisados ​​utilizando o teste de Kruskal-Wallis (A) , o coeficiente de correlação de Spearman (B) e o teste de soma de postos de Wilcoxon (C, D) . *Diferenças significantes.

Quanto a expressão de CD38 em células CD8 + de células T, a expressão global não se alterou durante 52 semanas ( P  = 0,913), e não houve diferença na proporção entre os grupos de remissão e nonremission na Semana 52 ( P  = 0,453 para CDAI, P  = 0,345 para SDAI).

Discussão

Neste artigo, relatamos os resultados do primeiro estudo abrangente para mostrar o efeito da TCZ em vários subconjuntos de células periféricas. Neste estudo, demonstrámos que a proporção de células T CD4 + CD25 + CD127 baixo t reg células entre células CD4 + células e a proporção de HLA-DR + -activated T reg células T entre reg células aumentou significativamente a partir da linha de base ao longo do curso do tratamento com TCZ, e também que as proporções de CD20 + CD27 + células B de memória, HLA-DR + CD14 + em monócitos activados, de CD69 + CD14 + em monócitos activados, e CD16 + CD14 + monócitos não clássicos diminuiu significativamente a partir da linha de base. Entre eles, apenas o aumento em T- reg células foi significativamente associada com a realização de remissão pelo tratamento TCZ.

Estudos relacionados têm relatado o aumento da T reg níveis de células de 1 ano após a administração TCZ em uma pequena população [ 20 ], durante 3 meses [ 15 ] e até 6 meses [ 12 ]. Embora definições de T reg células do nosso estudo, usando apenas marcadores da superfície celular, sem modificação estimulador para as células in vitro , foram diferentes daquelas nestes estudos anteriores, nossos resultados mostraram as mesmas tendências como publicado anteriormente.O mecanismo é uma questão que ainda não está totalmente compreendido. No entanto, isso ainda é um biomarcador importante, já que nenhum biomarcador adequado que pode ajudar a prever o resultado da RA não foi identificado.

Vários mecanismos podem contribuir para a potenciação de T reg células por terapia TCZ. É concebível que a IL-6 tem um efeito sobre o t Reg diferenciação através da inibição da expressão de um factor de transcrição específico, FoxP3 [ 21 , 22 ].Isto pode sugerir um mecanismo pelo qual a neutralização de IL-6 de sinalização em doentes com AR pode induzir um aumento no número e a função de T reg células. O aumento quantitativo em T- reg células que expressam níveis elevados de antigénio de leucócitos humanos (HLA) -DR em pacientes com AR tratados com TCZ também poderia ser um resultado da activação e proliferação de preexistente T reg células ou da sua diferenciação por conversão de Foxp3 precursores .

Uma questão que se coloca é o resultado de se o aumento de T Reg proporção após a terapia TCZ é um resultado de remissão da doença ou é atribuível ao uso de TCZ. Para responder à pergunta, nós também analisados ​​T periférica regcélulas em 12 pacientes com RA longitudinalmente tratados com MTX sozinho (arquivo adicionais 1 : Tabela S4). Todos os pacientes obtiveram LDA ou de dispensa na semana 52 após o início do tratamento com MTX (arquivo adicionais 1 : Figura S3). A proporção de T reg células não mostram uma certa tendência ou mudança de mais de 52 semanas após a administração de MTX ( P  = 0,729) (arquivo adicionais 1 : Figura S4A). Além disso, a mudança de T reg células na semana 52 não foi associada com a mudança na pontuação CDAI e SDAI na semana 52 (arquivo adicionais 1 : Figura S4B). Estes resultados sugerem que, embora a comparação em um pequeno número de pacientes com MTX, o aumento do T Regproporção após a terapia TCZ não é um resultado de remissão da doença, mas causada por terapia TCZ si.

Outra questão é se outros agentes biológicos para o tratamento RA também induzem T reg células. Tem sido relatado que nem adalimumab, um factor anti-necrose tumoral (anti-TNF) mAb, nem o etanercept, um receptor de TNF solúvel, percentagens modificados ou números absolutos de circulantes CD4 + CD25 alta T reg células ou outras T reg fenótipos depois de ser administrada durante 6 e 12 semanas para os pacientes com AR, independentemente da sua resposta [ 23 ].No entanto, existe um relatório que altas concentrações de TNFa pode bloquear as funções imunossupressores de T regcélulas in vitro e que o tratamento de doentes com RA com infliximab, um anti-TNF mAb, reforça T Reg supressão da proliferação de células efectoras [ 24 ]. Supõe-se que estes resultados conflituosos pode ser atribuída a um pequeno número de indivíduos ( N  = 10 a 30) e um período de observação curto (12 a 24 semanas). Em relação abatacept, a terapia diminui o número absoluto de T reg células, mas aumenta a sua função em pacientes com AR [ 25 ]. É concebível que os diferentes alvos destas terapias influenciar o desempenho diferente de T reg células e que os resultados do presente estudo indicam uma parte do mecanismo único de TCZ.

Embora ainda há muito a ser esclarecido sobre como T reg defeitos podem contribuir para a patogênese da AR, aproxima-se especificamente impulsionar T reg atividade pode ser útil no tratamento da AR. Neste estudo, a alteração em T Reg foi correlacionada com a actividade da doença após a terapia TCZ. Esta é a primeira vez que o efeito do aumento da T Reg tem sido mostrado para ser rigorosamente relacionado com a eficácia clínica.

Os efeitos da IL-6 no final da fase de diferenciação da célula B in vitro são bem documentadas [ 26 ]. In vivo de IL-6 sobre-expressão está associada a hiperactividade das células B, produção de auto-anticorpos e imunopatologia [ 27 , 28 ]. Em pacientes com AR, a activação crónica de células B e uma acumulação de células B de memória no sangue periférico e as membranas sinoviais têm sido descritas [ 29 , 30 ]. Dentro deste contexto, as terapias alvo de células B utilizando rituximab têm sido amplamente explorado na AR. Uma vez que a IL-6 tem sido descrito como um importante factor de estimulação de células B, com efeitos sobre a sobrevivência das células B de memória e sobre a diferenciação das células no plasma e a sobrevivência na medula óssea, é fácil de compreender o efeito da TCZ em células B periféricas, especialmente o proporção de células B virgens de células de memória B [ 31 ]. Embora a proporção de células B de memória diminuiu significativamente ao longo de 52 semanas de terapia TCZ, não se correlacionou com nenhum componente do status de atividade, SJC, TJC, Pt-VAS, D-VAS, PCR e VHS. Portanto, a redução pode ser atribuída ao efeito da terapia TCZ em vez de para a actividade da doença. Quando comparamos a proporção de subconjuntos de células B nos mesmos 12 pacientes que foram efetivamente tratados apenas com MTX durante 52 semanas como mencionado acima (arquivo adicionais 1 : Tabela S5), observou-se que a proporção de células B de memória tende a diminuir em pacientes com o tratamento com MTX, como no caso com TCZ, sugerindo que a tendência não era específico para a terapia TCZ. No entanto, as proporções de CD80 + e CD86 + células B entre todas as células B não se alterou em pacientes que receberam tratamento com MTX.Por conseguinte, a diminuição da proporção após a terapia TCZ pode ser característica de TCZ.

No sangue periférico, duas subpopulações de monócitos com propriedades funcionais distintas foram definidas pela sua expressão de moléculas CD14 e CD16. Comparado com CD14 clássica + CD16 monócitos, CD16 + monócitos não clássicos têm mostrado possuir várias características de macrófagos teciduais inflamatórias, nomeadamente, maior expressão do complexo de histocompatibilidade principal antigénios da classe II e várias moléculas de adesão e menor expressão de IL-10, de crescimento transformante β fatores, macrófagos fator estimulante de colônias, IL-1b e TNF? [ 32 ]. A importância fisiopatológica do CD16 + subconjunto de monócitos não clássica foi demonstrada pela sua expansão sob várias condições inflamatórias, tais como a AR, sépsis, asma e tumores sólidos. Nós demonstramos que TCZ reduziu o nível periférico de CD16 + monócitos não clássicos. Embora ainda não se esclareceu como monócitos diferenciam-se em CD16 + monócitos não-clássicas, este estudo revelou que a IL-6 parece estar envolvido na proliferação de CD16 + monócitos não-clássicas ou mudar o equilíbrio de monócitos ao CD16 + monócitos não-clássicas. Nos mesmos 12 pacientes com AR descrito acima, que foram tratados com MTX sozinho, as proporções de HLA-DR + CD14 + monócitos e CD69 + CD14 + monócitos entre todos os monócitos não se alterou (arquivo adicional 1 : Tabela S5), que era diferente a partir dos resultados para TCZ. A diminuição dos monócitos ativados após a terapia TCZ não parecem ser a causa da remissão da doença, mas sim o efeito de TCZ. A percentagem de CD16 + CD14 + monócitos não clássicos tenderam a diminuir durante 52 semanas de tratamento com MTX em comparação com a de terapia TCZ. Este pode ter sido um resultado da melhoria da atividade da doença RA, ou pode algumas ações sobre as células imunes em comum entre TCZ e MTX.

conclusões

Nossos resultados sugerem que TCZ afetados proporções de T circulantes reg células, células B e monócitos em pacientes com AR. Especialmente, o aumento da proporção de T reg células entre células CD4 + células T bem correlacionados com a resposta clínica. Em seguida, o possível modo de acção do RA TCZ contra poderia aumentar a proporção de T reg células.

abreviaturas

ACPA: 

anticorpo proteína Anticitrullinated

ACR: 

American College of Rheumatology

CCP: 

peptídeos cíclicos citrulinados

CDAI: 

Clínica Índice de Atividade da Doença

PCR: 

proteína C-reativa

csDMARD: 

medicamento anti-reumático modificador da doença sintética convencional

D-VAS: 

escala visual analógica do médico

ESR: 

Taxa de sedimentação de eritrócitos

EULAR: 

Liga Europeia contra o Reumatismo

HAQ-DI: 

Avaliação de Saúde Disability Index Questionário

HDA: 

alta atividade da doença

IL-6R: 

receptor de interleucina-6

IQR: 

intervalo interquartil

LDA: 

baixa atividade da doença

mAb: 

O anticorpo monoclonal

MDA: 

atividade da doença moderada

MMP-3: 

Metaloproteinase de matriz-3

MTX: 

metotrexato

PBMC: 

células mononucleares do sangue periférico

Pt-VAS: 

escala visual analógica do paciente

RA: 

Artrite reumatóide

RF: 

Fator reumatóide

SDAI: 

Simplificado Índice de Atividade da Doença

SJC: 

contagem de articulações inchadas

TCZ: 

tocilizumab

TJC: 

contagem de articulações Tender

TNF: 

Fator de necrose tumoral

Treg: 

células T reguladoras

declarações

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pela Chugai Pharmaceutical Co, Ltd.

Referências

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direitos autorais

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